3%β-甘油磷酸钠 5ml
2%巴比妥钠 5ml
蒸馏水 10ml
2%CaCl 2 10ml
2%MgSO 4 1ml
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31ml
上液用 1N NaOH将pH调至9.3～9.4。
2 ）材料：肾脏冰冻切片
3 ）实验步骤：
• 肾冰冻切片用冷丙酮或 95% 酒精固定 15 分钟。
• 蒸馏水洗数次，约 1~2 分钟。
• 入 预温的 37 ℃孵育液中孵育 4～6小时。
• 自来水洗数次。
• 2% 硝酸钴中浸 3~5 分钟。
• 蒸馏水洗数次。
• 1% 的硫化铵中 2 分钟。
• 自来水冲洗。
（ 9 ） 2% 甲绿复染 10~15 分钟，流水冲洗。
（ 10 ）晾干，封片。
对照： 孵育液中去掉β -甘油磷酸钠。
4 ）结果：阳性部位呈棕黑色或黑色，细胞核呈绿色。
5 ）原理： β -甘油磷酸钠在碱性磷酸酶的作用下水解（pH9.3～9.4）产生磷酸根，磷酸根与 孵育液中的钙离子结合成磷酸钙，与硝酸钴反应产生磷酸钴，磷酸钴与硫化铵反应形成棕黑色硫化钴沉淀。
2 、显示酸性磷酸酶的铅法 酸性磷酸酶 (Acid phosphatase,AcP) 主要分布于巨噬细胞等一些具有吞噬分解能力的细胞。
1 ）孵育液：
蒸馏水 74ml
0.5mol醋酸缓冲液（pH4.7） 12ml
5%Pb（NO 3 ） 2 2ml
3.2%β-甘油磷酸钠 4ml
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92ml
上液用之前现配并用 1N HCl将pH调至4.7。
2 ）材料：血涂片或组织冰冻切片
3 ）实验步骤：
• 血涂片或冰冻切片用冷丙酮或 95% 酒精固定 15~30 分钟。
• 蒸馏水洗数次，约 1~2 分钟。
• 入 预温的 37 ℃孵育液中孵育 2小时。
• 蒸馏水洗数次。
• 1% 的硫化铵中 3 分钟。
• 自来水冲洗。
• 2% 甲绿复染 10~15 分钟，流水冲洗。
• 晾干，封片。
对照： 孵育液中去掉β -甘油磷酸钠。
4 ）结果：阳性部位呈棕色或棕黄色，细胞核呈绿色。
5 ）原理： β -甘油磷酸钠在酸性磷酸酶的作用下水解（pH4.7～5.0）产生磷酸根，磷酸根与 孵育液中的硝酸铅反应产生磷酸铅，磷酸铅与硫化铵反应形成棕色硫化铅沉淀。
3 、显示碱性磷酸酶的萘酚 AS-BI 法
1 ）孵育液：萘酚 AS-BI 原液：萘酚 AS-BI 磷酸 2.5mg ， N ∶ N '－二甲基甲酰胺 1ml ，蒸馏水 1ml ， 1mol 碳酸钠 1~2 滴。上述液体顺序加入，摇匀，用 1mol 碳酸钠调 pH 至 8.0 ，然后加入下液：蒸馏水 30ml ， 0.2mol tris 盐酸缓冲液 pH8.3 18ml 。孵育液：萘酚 AS-BI 原液 10ml ，坚牢红 TR10mg ，混合过滤后立即使用。
2 ）材料：肾脏冰冻切片
3 ）实验步骤：
• 肾冰冻切片用冷丙酮或 95% 酒精固定 15 分钟。
• 蒸馏水洗数次，约 1~2 分钟。
• 入萘酚 AS-BI 孵育液室温孵育 5~10 分钟。
• 蒸馏水速洗。
• 入 2% 甲绿复染 3~5 分钟。
• 蒸馏水速洗，晾干。
• 甘油明胶封片。
对照：去掉萘酚 AS-BI 或坚牢红。
4 ）结果：阳性部位为红色，胞核为绿色。
5 ）原理：萘酚 AS-BI 磷酸在 pH8.3~9.2 的环境下，被碱性磷酸酶水解的产物与坚牢红结合为红色沉淀物。
4 、显示酸性磷酸酶的萘酚 AS-BI 法
1 ）孵育液：萘酚 AS-BI 原液：萘酚 AS-BI 磷酸 50mg ， N ∶ N '－二甲基甲酰胺 5ml 。氯偶氮付品红原液：六偶氮付品红 1g ，蒸馏水 20ml ，盐酸 5ml 。亚硝酸钠液：亚硝酸钠 0.4g ，蒸馏水 10ml 。 Veronal 醋酸缓冲液 pH5.0~5.5 。孵育液：萘酚 AS-BI 原液 0.5ml ，氯偶氮付品红原液和亚硝酸钠液的混合液 0.8ml ， Veronal 醋酸缓冲液 2.5ml ，蒸馏水 6.5ml 。用 0.1N NaOH 调 pH 为 4.7~5.0 。
2 ）材料：肝脏冰冻切片。
3 ）实验步骤：
• 冰冻切片用冷丙酮或 95% 酒精固定 15 分钟。
• 蒸馏水洗数次，约 1~2 分钟。
• 入萘酚 AS-BI 孵育液 37 ℃ 孵育 30~40 分钟。
• 蒸馏水速洗。
• 入 2% 甲绿复染 3~5 分钟。
• 蒸馏水速洗，晾干。
• 甘油明胶封片。
对照：去掉萘酚 AS-BI 或六偶氮付品红。
4 ）结果：阳性部位呈红色，细胞核呈绿色。
5 ）原理：在 pH 为 4.7~5.0 的环境中，酸性磷酸酶水解萘酚 AS-BI 磷酸的产物与六偶氮付品红和盐酸的反应产物氯偶氮付品红结合形成红色的沉淀物。
5 、显示脱氢酶的四唑盐法 脱氢酶是催化氧化还原反应的一大类酶，如琥珀酸脱氢酶（ SDH ）和乳酸脱氢酶（ LDH ），显示方法相似，反应底物不同。在此，仅介绍显示 SDH 的四唑盐法， SDH 主要分布于线粒体。
1 ）孵育液：磷酸缓冲液： 1/15mol Na 2 HPO 4 80.4ml ， 1/15mol KH 2 PO 4 19.6ml ，配成 1/15mol 磷酸缓冲液， pH 调至 7.4 。孵育液： 0.2mol 琥珀酸钠 15ml ， 1/15mol 磷酸缓冲液 15ml ， 0.1% 的硝基蓝四唑（ NBT ） 15ml 。孵育液用时现配，必要时可过滤。
2 ）材料：肝脏冰冻切片。
3 ）实验步骤：
• 冰冻切片用冷丙酮固定 1~2 分钟。
• 蒸馏水略洗。
• 浸入孵育液 37 ℃ 孵育 1~2 小时。
• 蒸馏水略洗。
• 1% 沙黄 O 复染 1~2 分钟。
• 蒸馏水速洗，晾干或吸干。
• 甘油明胶封片。
对照：切片经 10% 甲醛处理 5 分钟，则 SDH 反应阴性。
4 ）结果： SDH 阳性部位呈深蓝色，核呈红色。
5 ）原理：在 SDH 催化的氧化还原反应中，氢的供体把氢原子传递给受氢体，然后由受氢体把氢原子传递给四唑盐，使四唑盐转变为蓝色的产物。
五、 免疫组织化学方法
以往显示蛋白质的方法有很多，如，汞－溴酚蓝法、坚牢绿法和茚三酮－ Schiff 反应等。免疫组织化学方法（ immunohistochemistry ）是利用抗原抗体特异结合的原理，用标记抗体与组织中的蛋白质抗原结合从而对蛋白质进行定性、定位乃至定量研究的组织化学技术。免疫组织化学方法应用到组织化学之后，以其定性、定位准确和灵敏度高、特异性强等优点而逐渐成为显示蛋白质的最常用、最可靠的组织化学方法。其他方法则很少再被采用了。
免疫组织化学的方法很多。根据标记物的性质可分为如下几种：
1 、免疫荧光法（ immunofluorescence technique ）。
2 、免疫酶法（ immunoperoxidase technique ）。
3 、免疫金银法（ immunogold technique ）。
4 、 ABC 法（ avidin-biotin complex technique ）。
5 、其他方法：如放射免疫法等。
此外，根据染色及抗体滴加的步骤，又可以分为直接法、间接法和桥法等。在此仅介绍较常用的 ABC 法。
1 ）试剂：兔抗鼠 Ⅳ型胶原抗体（一抗）；生物素标记羊抗兔抗体（标记二抗）；亲和素 -生物素-过氧化物酶复合物（ABC）；3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色液；0.3%过氧化氢（0.01mol PBS配制，含40%甲醇）。抗体的稀释度应照产品说明试行。
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